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使用酶联免疫分析（ELISA）检测蛋白质（抗原或抗体）是全世界最容易获得的诊断工具之一，目前在养猪业中大量使用。该测试通常用于监控和疾病监测以及诊断工具。由于猪兽医经常使用该方法，因此在解释结果时了解检测的工作原理、检测的内容及其优缺点至关重要。同样重要的是要记住，虽然相同的技术可用于不同的病原体，但对这些结果的解释应该有所不同。
检测基本信息
ELISA检测旨在检测针对细菌或病毒的抗原或抗体。抗原是刺激抗体产生的外来蛋白质（抗原=抗体生成剂）。在考虑抗体时，总是认为它们是针对蛋白质的。在设计检测方法时，制造商或实验室决定他们想要针对的特定蛋白质。如果ELISA直接靶向细菌或病毒的蛋白质，则称为抗原ELISA，而如果目标是动物对细菌或病毒的抗体反应，则称之为抗体ELISA。尽管有设计成仅针对一种或两种蛋白质（抗体或抗原）的ELISA测定，但实际上许多ELISA测定都针对大量蛋白质。还可以设计检测特定类型的抗体反应（IgG、IgM或IgA）或这些反应的组合。这些类型的抗体中的每一种都具有特定的功能，这不属于本文介绍的范围。
通过ELISA检测抗体或抗原的概念和过程完全相同。它从获得目标蛋白（抗原或抗体）开始。对于单个蛋白质，需要单独的方法来获得该单个蛋白质的纯化浓度。确定目标蛋白是一个科学而复杂的过程。理想情况下，该检测针对特定病原体的特有单一蛋白（不与其他病原体交叉反应）、高度免疫原性（用于抗体检测）或高浓度（用于抗原检测）；它靶向一种已知与疾病防护高度相关且始终存在的蛋白质。不幸的是，这些标准中有许多是未知的，且可以容易地在样品中产生和发现这种单一蛋白质，或者多个蛋白质的混合物（即全病毒或细菌）通常被用来替代。虽然使用全病毒或细菌作为目标蛋白可能很容易，但与其他病原体交叉反应的机会很多。
该过程的一般步骤如下 (见图1).
- 步骤1：用目标抗原（用于检测抗体）或抗体（用于检测抗原）预涂微孔板。
- 步骤2：添加样品进行测试并孵育，以使抗原和抗体之间发生附着。
- 步骤3：移除样品，并添加附着在抗体（抗体检测的“Y”部分底部）或抗原（抗原检测的“Y”顶部）相对侧的特定抗体。然后孵育样品以确保附着，并洗涤以确保去除任何非附着（即非靶向）抗体或抗原。
- 步骤4：添加用能发出荧光的检测器标记的抗体，并将其附着在步骤3中添加的特殊抗体上（附着在抗体“Y”部分的底部；抗原或抗体检测的目标相同）。然后再次孵育样品以确保附着，并洗涤以确保去除任何未附着的标记抗体。
- 步骤5：添加将触发残留的标记抗体荧光的试剂，然后进行孵育以确保附着。
- 步骤6：读取样品，通常使用特定波长的专用机器来量化颜色变化（称为吸光度）。这一过程在检测方法是直接、间接还是夹心ELISA方面有一些细微的差异，每种检测方法都有不同的优点和缺点（此处未讨论），但最终结果相同；吸光度或颜色变化越高，测试样品中目标抗原或抗体的预期浓度越高。
1. 将样品加入微孔
2. 蛋白质附着于塑料上
3. 偶联检测抗体与固定化分析物结合
4. 酶促显色反应与结合抗体成正比
夹心法：
1. 用捕获抗体预涂微孔
2. 添加样品，分析物与捕获抗体结合
3. 偶联检测抗体与固定化分析物结合
4. 间接检测，酶促反应与分析物成正比
竞争法
1. 用第二捕获抗体预涂微孔
2. 同时加入捕获抗体、偶联物和样品
3. 偶联物和样品结合
4. 酶促显色反应与结合偶联物成正比
untargeted sample matrix：非目标样本矩阵
targeted analyte: 目标分析物
antibody: 抗体
enzyme- conjugated analyte: 酶偶联分析物
biotin-streptavidin binding: 生物素-链霉亲和素结合
enzyme- conjugated(AP/HRP): 酶偶联(AP/HRP)
enzymatic substrate: 酶底物
color reaction product: 显色反应产物
在竞争ELISA的情况下，关键是所使用的过程实际上会产生相反的结果（见图2B）。将样品和已知量的标记抗原（用于抗原检测）或抗体（用于抗体检测）添加到待评估的样品中，以便一旦将它们添加到标记孔中，原始样品和添加的标记蛋白（抗体或抗原）竞争附着在预涂孔上。本质上，如果待测样品中没有目标蛋白质，则所有标记的蛋白质将能够附着在平板上并产生强烈的颜色变化。另一方面，如果样品中有相当数量的目标蛋白质，则样品中的蛋白质将与标记的蛋白质竞争（阻止）结合。当洗涤样品时，任何未附着的标记蛋白将通过洗涤去除。因此，样本中的抗原或抗体越多，它们就越能阻挡标记的蛋白质，从而导致它们不附着并被洗掉。当样品中目标蛋白的浓度高时，这会导致低吸光度，这与之前的情况相反。高值表示低浓度或阴性结果，无法量化阳性样品的抗原/抗体浓度。
每个ELISA测定的测定截止值可以不同，并且由制造商根据其期望的靶向敏感性和特异性预先确定。对于直接、间接或夹心ELISA，任何高于截止值的数字都被视为阳性。对于竞争性ELISA，任何高于临界值的数字都被视为阴性。对于某些分析，他们还建立了一个灰色区域，将样本分类为“可疑”，因为分析往往会有一些“背景”反应（交叉反应），这使得很难有一个明确的临界点。
结果通常（但不总是）报告为校正的S:P或样本与阳性的比率，该比率根据阴性对照孔中发现的背景颜色变化进行校正。抗体水平通常被称为“滴度”。虽然这在技术上是不正确的，但从宏观角度来看，它是合理的。一个关键点是，当谈到滴度时，值之间存在直接的数学关系（值为20的样本的抗体数量是值为10的样本的两倍）。对于ELISA值，不存在这种直接的数学关系（见图2A）。2.0的ELISA确实比1.0的具有更多的抗体，但不是1.0的两倍。
合并用于测试的样本
由于ELISA测定是浓度依赖性的（与靶蛋白[抗体或抗原]的浓度直接相关），因此强烈建议不要合并进行检测。合并可显著增加丢失阳性样本的可能性。
测定的一些用途：
- 检测是否存在针对目标病原体的抗体 – 抗体 ELISA – 最常见的用途
- 确定病原体暴露
- 确定动物的疫苗接种状态
- 确定感染时间（抗体水平的变化）随时间的变化。
- 通过检测目标病原体的蛋白质/抗原来检测目标病原体的存在 – 抗原 ELISA
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